甲基化案例2

標準化分析 > DNA測序 > 表觀組學 > 甲基化案例2

Critical roles of DNA demethylation in the activation of ripening-induced genes and inhibition of ripening-repressed genes in tomato fruit
PNAS 2017
doi/10.1073/pnas.1705233114
 
背景:
 
DNA甲基化(DNA methylation)是最早發現的遺傳修飾途徑之一。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變,從而控制基因表達。
在植物中,DNA甲基化的堿基有兩類:6-甲基腺嘌呤(6-mA)和 5-甲基胞嘧啶(5-mC),其中以胞嘧啶的甲基化為主。植物胞嘧啶甲基化主要有兩個特點,一是除了會發生在CG位點之外還會發生在CHG(H代表A、C、T中的任何一種堿基)和CHH位點上。胞嘧啶的甲基化水平是由DNA甲基化和去甲基化反應共同調節的。
DNA去甲基化主要有兩種類型,被動DNA去甲基化,比如既DNA復制過程中甲基化的丟失和主動去甲基化,比如甲基化主動被某些酶移除。在擬南芥中已有研究證明一些酶和主動DNA去甲基化相關聯,如在DNA去甲基化通路上游發揮作用的ROS1家族基因。 由于DNA過甲基化會造成基因的表達下降,因此DNA去甲基化又被當做是抗表達沉默調節因子,或者說是對提高基因活性有幫助。
目前,主動DNA去甲基化在植物中的研究更多是在模式植物擬南芥中,而在作物中的研究仍舊缺少,例如棉花的纖維生長通路以及番茄的肉質果實的成熟通路。番茄是一種重要的經濟作物同時也是研究肉質果實成熟機制的模式物種。肉質果實的成熟伴隨著明顯的生理生化結構變化,比如糖,香味揮發物以及色素的積累和細胞壁的水解作用,這些變化受植物激素和生長發育相關因子影響,其中乙烯最重要的幾種因子之一,尤其是對于即將成熟的果實,成熟期的果實會出現乙烯含量急速增長的現象。此外,還有一些成熟相關轉錄因子,包括RIN, NOR, CNR等也被鑒定出。目前已有研究證明除乙烯和成熟相關轉錄因子之外,DNA甲基化是果實成熟的另一類關鍵調節因子。具體來說,番茄成熟期內經受冷害而丟失風味和 DNA甲基化相關。
 
基于和擬南芥DNA去甲基化基因的同源比對,番茄中共有四個可能的DNA去甲基化酶相關基因,其中SlDML1和SlDML2和擬南芥中ROS1基因幾乎一致。先前的研究通過RNAi來破壞HhH-GAP功能域的方式來調查番茄中四個SlDML基因的功能,處理與否的SlDML2基因的表達量變化最大,而且處理過的植株出現了明顯的晚熟表型,說明SlDMLS在水果成熟中的關鍵作用。但由于RNAi并未靶向某個特殊的SlDML基因,所以不清楚是哪一個SlDML基因在發揮作用,同時,果實成熟過程中主動DNA去甲基化的全基因組效應還未被確定。
 
主要材料方法:
1. 數據
  • 文章所測的甲基化和轉錄組數據已經上傳到NCBI GEO,數據編號為GSE94903。
  • 參考基因組:
SL2.50 (ftp://ftp.solgenomics.net/tomato_genome/assembly/build_2.50)
  • 文章中用到的其他數據來自Zhong S, et al. (2013) Single-base resolution methylomes of tomato fruit development reveal epigenome modifications associated with ripening. Nat Biotechnol 31: 154–159
 
2. 實驗材料
     所用材料為來自普渡大學西拉法葉校區溫室種植的球形番茄品種Micro-  Tom。
 
3. 主要分析流程:
  • 甲基化測序和分析:
甲基化測序通過全基因組亞硫酸鹽測序的方式;
原始序列的質控(q>=20)和比對通過BRAT-BW進行;
甲基化差異胞嘧啶(differentially methylated cytosines,DMC)和甲基化差異區(differentially methylated region,DMR)鑒定的步驟根據文章“Tang K, Lang Z, Zhang H, Zhu JK (2016) The DNA demethylase ROS1 targets genomicregions with distinct chromatin modifications. Nat Plants 2:16169”中的流程進行鑒定。
  • 轉錄組分析
原始序列的質控通過Fastqc和FASTX-Toolkit進行,參數為“-f 14 –l 80”;
質控后的序列通過TopHat2比對到參考基因組,featureCount用于計算每個基因的比對序列數目,并通過edgeR計算每個基因的log2fold值;
R被用于Kmeans聚類;熱圖通過Matrix2png繪制。
 
 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
主要結果
 
1. 通過CRISPR/Cas9 基因編輯系統獲得穩定的SlDMLS2功能丟失突變體。
 
經過CRISPR/Cas9 基因編輯后并經PCR實驗驗證后,得到三株SlDML2基因第一個外顯子缺失變異的純和突變體,其中兩株的變異完全相同,缺失變異長度為2bp,另外一株的缺失變異長度為28bp。這兩類變異都被預測可以造成SlDML2第一個外顯子的提前終止密碼子變異。28bp缺失變異的突變體命名為sldml2-1而2bp缺失變異的突變體命名為sldml2-2
 
2. sldml2 突變體的變異抑制果實成熟
 
從表型上(果實顏色和種子數量)兩類突變體在和對照植株(WT)在46dpa(46 days after pollination, 授粉后46天 )和60dpa的果實分別比較發現,突變體的變異對果實成熟抑制明顯(Fig. 1)。

Fig. 1 sldml2突變體果實成熟期表型。
 
3. sldml2 突變體造成全基因組DNA甲基化
 
對WT和sldml2-1在25dpa和46dpa分別進行了全基因組亞硫酸鹽測序(bisulfite sequencing),其中各個樣本的基因組胞嘧啶超過95%均有序列覆蓋,甲基化組測序覆蓋平均深度超過10.7x。
為了鑒定在果實中的SlDML2基因的靶向位點,對WT-46dpa和sldml2-1-46dpa的甲基化組進行了比較分析。其中在sldml2-1-46dpa的兩個重復中分別鑒定出了21515和23026個hyper-DMR(高甲基化差異區),6643和6689個hypo-DMR(低甲基化差異區)。hyper-DMR的數量遠高于hypo-DMR,符合之前假設SlDML2基因的去甲基化功能的猜想。另一突變體sldml2-2也有相同結果(Fig. 2B).
 

Fig. 2 sldml2突變體果實成熟期全基因組DNA過甲基化分布。
 
在擬南芥中,去甲基化相關基因AtROS1優先靶向TE(transposable elements,轉位因子)。sldml2突變體中的hypo-DMR的45%靶向為TE, 43.7%為IG(Intergenic region, 基因間區),說明SlDML2基因在番茄中優先靶向TE和IG(Fig. 3A)。同時SlDM2基因的甲基化靶向位點在染色體上的更趨向于染色體臂而非擬南芥AtROS1基因更趨向著絲粒(Fig. 3B)。
在番茄,玉米和水稻等作物中均發現基因5‘端距離500bp, 1000bp和2000bp位置有TE的比例要大于擬南芥(Fig. 3E)。說明,和擬南芥相比番茄等作物的基因更容易受臨近TE的甲基化狀態影響,因此DNA去甲基化在調節作物的基因表達量會比擬南芥中發揮更大的作用。

Fig. 3 sldml2突變體甲基組特性
 
 
4. 成熟誘導的DNA去甲基化過程需要SlDML2 基因的參與。
 
通過比較WT-25dpa和WT-46dpa的甲基化組,共鑒定出3306個hyper-DMR和13106個hypo-DMR低甲基化,其中13106個hypo-DMR在WT-60dpa時仍舊保持低甲基化狀態,說明低甲基化狀態在成熟的后期繼續保持(Fig. 4B)。而在sldml2-1突變體中,從25dpa到46dpa,13106個 hypo-DMR的DNA甲基化水平并未降低,說明果實成熟誘導的DNA去甲基化過程需要SlDML2基因的參與(Fig. 4A),這也在在另外一個番茄品種CV的甲基化組數據中得到驗證。
在將sldml2突變體中的DMR和這13106個hypo-DMR進行比較后,共發現8176個hypo-DMR和sldml2突變體的hyper-DMR重疊,和同時期的WT相比,這8176個hypo-DMR的甲基化水平明顯增加,但未重疊的hypo-DMR突變體DNA甲基化水平也同樣比WT高,說明這13106個hypo-DMR均是由SlDML2所控制的(Fig. 4B)。
 

Fig. 4  成熟誘導過程中不同樣本的甲基化水平變化趨勢
 
 
 
5.  由SlDML2調節的DNA去甲基化同樣有沉默基因功能。
   我們對WT-25dpa,WT-46dpa以及sldml2-1-25dpa以及sldml2-1-46dpa的兩個重復進行了基因表達量測定。 在12902個hyper-DMR相關基因中,篩選出共6651個是至少有表達的基因用于接下來的分析。 通過k-means聚類的方式,將6651個基因分成三類,第一類605個基因,成熟期在WT表達量上調而突變體中下調,第二類598個基因,成熟期在WT下調而在突變體表達量上調,第三類,沒有明顯變化趨勢。
 
第一類基因在sldml2和WT-46dpa的比較結果中是呈現DNA高甲基化,而表達量是下降的,這一般概念認為的DNA高甲基化和轉錄低效相互關聯是一致的。如Fig.5B中,突變體的第一類和第二類基因在基因的上游區域均發生高甲基化現象。同時通過比較未成熟果實和成熟果實的表達量數據,發現第一類基因在果實成熟期在兩個番茄品種中(Micro-Tom和AC)均是上調,同時在啟動子區域同時出現DNA去甲基化現象,而在突變體中正好相反,說明SlDML2基因對于調節DNA去甲基化從而提升成熟誘導基因的轉錄活性是必要的,即SlDML2基因對于這類基因是有抗沉默功能的。
 
    突變體第二類基因的表達量水平明顯高于兩個番茄品種,說明突變體中的二類基因的DNA高甲基化對于保持活性的二類基因很重要。在兩個番茄品種的二類基因表達量受到抑制而同時又存在去甲基化現象,說明SlDML2基因對于成熟過程中表達量受到抑制的基因具有沉默的功能。

Fig. 5 SIDML2調節基因的DNA去甲基化和表達量的關聯性
 
 
6.  SlDML2 基因激活或抑制的基因的功能
 
    通過GO富集結果發現,第一類基因在類黃酮生物合成和類胡蘿卜素生物合成這兩類中明顯富集。而第二類基因在光合作用和細胞壁合成通路上是明顯富集的。
    許多和果實成熟相關的重要基因屬于第一類基因,比如PSY1和ACS4基因,在果實成熟的WT中,被高度誘導表達,但在突變體中則相反(Fig.6A上半部)。在Fig6A下半部分中可以看到,兩個基因在WT成熟期出現去甲基化現象,而突變體保持甲基化水平,說明SlDML2基因是果實成熟誘導相關通路基因的去甲基化以及表達所需要的,這其中就包括色素合成,類黃酮生物合成以及果實軟化等通路。在Fig. 6B中,可以發現第二類基因的兩個代表基因SlCAP10B和SlRBCS-2A呈現出了符合預期的結果,同時也采用RT-qPCR的實驗手段再次驗證了結果是符合的。
 
 

Fig. 6 WT以及突變體的第一類和第二類代表基因的甲基化水平和表達水平變化
 
 
 
 
 
總結
 
該研究中,通過CRISPR/Cas9基因編輯系統產生了兩個番茄SlDML2功能確實的突變體,證實了SlDML2基因在番茄果實成熟過程中通過調節DNA甲基化位點來影響番茄果實成熟,其中鑒定出了全基因共29764個S1DML2調節的DMR,這些DMR優先分布在染色體臂,并優先靶向TE和IG。通過結合轉錄組數據分析,發現SlDML2基因調節的DNA去甲基化對于數以百計的果實成熟相關基因的啟動是必須的,包括RIN以及乙烯,色素合成以及細胞壁水解作用相關基因。同時出乎意料的是,也揭示了SlDML2基因調節的DNA去甲基化對于數以百計的果實成熟抑制基因也是必須的,這些抑制基因參與到了光合作用,細胞壁合成等通路,同時這類基因的受到抑制和啟動子區域DNA低甲基化水平相關聯。
 

深圳華大科技(總部)

電話:400-706-6615
郵箱:info@genomics.cn

服務熱線
025-58742321
地址:江蘇省南京市高新區惠達路9號南自園區C樓101
聯系人:丁先生
郵箱:project@jggene.com
手機:025-58742321
台湾佬中文娱乐综合网2,国产偷国产偷亚洲清高9714,免费的国产日产a在线播放,国产小视频福利合集在线观看,欧美香蕉有线在线播放,欧美日韩国产专区一区