三代轉錄組案例

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 通過單分子測序進行玉米和高粱間的比較轉錄組分析
A comparative transcriptional landscape of maize and sorghum obtained by single-molecule sequencing
DOI:10.1101/gr.227462.117
Genome Research 2018

背景
密切相關的物種之間基因組序列相似性極高等卻表現出巨大的形態差異,例如人類和黑猩猩之間由基因組和轉錄組比較共同確認的分子差異,這些差異是兩個物種之間轉錄和基因組共同作用的結果。此外,人和小鼠組織的轉錄本之間的比較顯示出相當多的轉錄表達情況可能可以解釋兩個物種之間的基本生理差異。在植物中,保守選擇性剪接事件已經在擬南芥和水稻之間、蕓薹屬和擬南芥以及水稻和玉米等多對物種中發現。然而保守選擇性剪接這樣的事件只在物種間中少量發現。
玉米和高粱具有非常相似的形態和系統發育結構,同時玉米和高粱是基因組序列層次上最相近的物種。盡管近期發表的玉米和高粱的RNA-seq數據揭示了發育過程中的基因表達模式,但很少有研究對這兩個物種的轉錄組進行比較,特別是在統一組織之間可變剪切的差異。雖然RNA-seq被廣泛應用于定量分析,但基于短序列序列組裝出來的轉錄本的精確度遠低于單分子長讀序的組裝結果。并且已有多項研究證明了單分子長讀序的功能性和可靠性,特別是用于識別全長轉錄本。

主要材料方法
1.    主要數據
選取玉米B73自交系14天的根、莖、葉和種子等組織,以及v8時期的葉耳,r1時期的花粉,授粉20天后的胚、胚乳和果皮,R1時期的絲,最深處的苞片。高粱BTx623 14天的根、莖、葉和種子等組織,授粉20天后的胚、胚乳和果皮,開花期123三個時期的花序。所有的組織都進行了超過10個個體的三個生物學重復的混池測序。
所有Illumina和Pacbio Iso-Seq都上傳到ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), 數據編號為E-MTAB-5957,E-MTAB-5915, 和E-MTAB-5956.
2.    主要分析流程
a. 基礎分析包括Illumina 數據RNA-seq,Pacbio數據比對,利用Pacbio數據鑒定lncRNA,以及Pacbio isoform的功能注釋和Wang 等*(2016)采用的方法一致。
* Wang B, Tseng E, Regulski M, Clark TA, Hon T, Jiao Y, Lu Z, Olson A, Stein JC, Ware D. 2016. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing. Nat Commun 7: 11708.
b. 單拷貝基因和倍增基因的鑒定:基于Ensembl Compara gene tree 的流程,以高粱基因作為古老基因進行鑒定,在玉米和高粱中都只有一個直系同源基因的為單拷貝基因,如果在高粱中有一個而玉米種有兩個直系同源基因,那么玉米中的直系同源基因被認為倍增基因。cleavage sites (CSs)
c. 可變聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,APA) 分析: 提取每個轉錄本的3'UTR中切割位點(cleavage sites, CS)上游50nt的序列,并使用SignalSleuth2對從1-40nt上游CS區域poly(A)基序進行掃描以鑒定靠近上游的元件(near upstream element, NUE)基序。來自每個組織的前10個基序用于物種之間和組織之間的比較。 為了測量聚腺苷酸化的組織特異性,我們將兩個物種間的11種組織種結束位置相聚5nt之間的所有全長轉錄本聚集在一起,并按照基因位點對不同組織在不同poly(A)位點的轉錄本進行分組。
d. 無義介導的衰變(Nonsense-mediated decay, NMD)候選的鑒定:為了確定可變剪切是否產生含有過早終止密碼子并且可能被NMD降解的全長轉錄本,我們首先通過EMBOSS預測每個全長轉錄本的最長ORF并計算出終止密碼子和最后一個外顯子結合點之間的距離。如果一個全長轉錄本的距離> 50 nt,而另一種<50 nt,然后AS事件被認為是產生了NMD候選。
e. Ka/Ks 值計算:對于每種生物,在同源基因組中隨機挑選至少基于BLASTPe值≤10-5的直系同源蛋白對,然后選擇BLASTP評分最高的直系同源蛋白進行進一步分析。 使用Clustal W 2.0蛋白質序列的比對,并Pal2Nal將蛋白質序列比對轉換為相應的密碼子比對。 根據Nei-Gojobori算法,使用KaKs_Calculator1.2計算Ka / Ks值。
f. 轉錄進化年齡指數(transcriptome age index, TAI)和轉錄分化指數(transcriptome divergence index, TDI)計算:
TAI和TDI是進化年齡和序列分化的加權平均值。計算公式如下:
 
其中s =每個組織,n=分析的基因總數。低PS值對應于進化上的舊基因,因此低TAI值對應進化上的舊轉錄組。同樣,高PS值對應于進化上的年輕基因,因此高TAI值對應于進化上年輕的轉錄組。通過類比,我們簡單地通過用Ka / Ks代替上述方程中代替psi來引入發育階段的轉錄組發散指數TDIs,計算公式如下:
 
因此,低或高Ka / Ks值比分別對應于保守或分化基因,因此低或高的TDI值對應于分別是保守或分化的轉錄組。



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