16S
16S18ITS擴增測序

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微生物16S測序
產品介紹
       16S rDNA是細菌分類學研究中最常用的“分子鐘”,其序列包含9個可變區(Variable region)和10個保守區(constant region)。可變區因細菌而異,且變異程度與細菌的系統發育密切相關。通過檢測16S rDNA的序列變異和豐度,可以了解環境樣品中群落多樣性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分類鑒定、微生態研究等方面起到重要作用。
       18S rDNA或ITS(Internal Transcribed Spacer)被廣泛應用在真菌分類鑒定中。18S rDNA在系統發育研究中較適用于種級以上階元的分類;ITS屬于中度保守區域,利用它可研究種及種以下的分類階元。 
 
研究內容
       16S/18S/ITS擴增子測序即通過提取環境樣品的DNA,選擇合適的通用引物擴增16S/18S/ITS的某一或某幾個區,使用Illumina測序將目的區域正反向讀通,通過檢測目的區域的序列變異和豐度,對環境樣本物種分類及,豐度,種群結構,系統進化,群落比較等方面信息進行分析的研究方法。
 
產品優勢
策略多樣:不同來源樣本采用不同提取方法和建庫測序策略,滿足多種環境研究需求
平臺多樣:MiSeq/HiSeq2500/HiSeq4000/PacBio等多種平臺可供選擇,可滿足16S/18S/ITS不同高變區域或全長測序的需求。
經驗豐富:已分析樣品類型涉及糞便、土壤、水體、唾液、牙菌斑、血液、皮屑等。
 

應用范圍

醫學領域:人體微生物與人體健康/疾病的關系,人體微生物對疾病干預過程的影響;
動物領域:腸道、瘤胃(如產甲烷菌類群)與動物健康/營養消化研究等;
農業領域:根際微生物與植物互作、農業耕作/施肥處理與土壤微生物群落等;
環境領域:霧霾處理、污水治理、石油降解、酸性礦水處理及海洋環境等;
特殊極端環境:極端環境條件下的微生物類群研究,如冰川、火山等。
 
 

 建庫流程

       16S/18S/ITS擴增子建庫推薦融合引物建庫方法,即提前合成融合了目標序列引物和上機接頭、index等序列的引物,通過一步PCR擴增直接完成建庫。主要步驟如下:
樣品檢測:使用Qubit對樣品濃度進行精確定量,檢測合格的樣品進行文庫構建。
PCR體系構建:取30ng DNA樣品及融合引物配置PCR反應體系。
PCR擴增:設置PCR反應參數進行PCR擴增。
產物純化:使用Agencourt AMPure XP磁珠進行純化并溶于Elution Buffer,貼上標簽,至此文庫構建完成。
文庫質量檢測:文庫檢測使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫的片段范圍及濃度。
上機測序:文庫檢測合格,上機測序
 

 測序策略

  擴增區域 引物名稱 引物對 測序類型*
細菌 V4 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA PE250
806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
V1-V3 8F AGAGTTTGATYMTGGCTCAG PE300
518R ATTACCGCGGCTGCTGG
V3-V4 341F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG PE300
806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
V4-V5 515F GTGCCAGCMGCCGCGG PE300
907R CCGTCAATTCMTTTRAGT
真菌 ITS1 its1 CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA PE250
its2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC
ITS2 its3 GCATCGATGAAGAACGCAGC PE300
its4 TCCTCCGCTTATTGATATGC

*注:只有兩端完全測通的Reads (Tags)才能用于進一步的分析,因此不同的擴增區域請嚴格遵循對應的測序類型。
 

生物信息分析

       下機數據經過數據過濾,濾除低質量的reads,剩余高質量的Clean data方可用于后期分析;通過reads之間的Overlap關系將reads拼接成Tags;在給定的相似度下將Tags聚成OTU,然后通過OTU與數據庫比對,對OTU進行物種注釋;基于OTU和物種注釋結果進行樣品物種復雜度分析以及組間物種差異分析。
信息分析條款 信息分析內容
數據處理 · 數據過濾
· Reads拼接
· OUT聚類與注釋
基于OUT的分析 · Rank Abundance
· PCA分析
· Venn圖
· Alpha多樣性分析
· 稀釋曲線、Chao曲線、Ace曲線、Shannon曲線、Simpson曲線 
· 組間樣品Alpha指數盒形圖及差異檢驗
· 基于OUT豐度beta多樣性分析
· Beta多樣性熱圖
· PCoA
· 樣品聚類樹
· CCA分析(需提供詳細的環境因子數據)
基于物種的分析 · 物種注釋柱形圖
· 物種豐度熱圖
· 物種系統發育進化樹
· 基于物種系統進化的(Un)weighted_UniFrac分析
1. Beta多樣性熱圖
2. PcoA
3. 樣品聚類樹
· 組間物種比較分析(Metastats)
LEFSE分析 · LEfSe組間群落差異分析
定制化信息分析 · 16S測序樣品功能預測(PICRUSt)
· 物種間相關系數網絡圖分析
· 可結合客戶的需求,協商確定定制化信息分析內容。
 
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