16S案例
16S18ITS擴增測序

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通過16S rDNA測序鑒定鈦種植體表面上的口腔細菌
Identification of oral bacteria on titanium implant surfaces by 16S rDNA sequencing
Clin Oral Implants Res. 2017 Jun;28(6):697-703.
doi: 10.1111/clr.12865




背景

商業上,純鈦(cpTi)和Ti-6Al-4V合金主要用于牙科和整形外科植入物,并且由于其良好的生物相容性,與適當的機械性能,已成為牙齒置換的成功選擇。然而,植入晚期失敗仍然會發生,最近的研究表明,20%的種植體周圍會發生炎癥,這與種植體表面的細菌生物膜形成密切相關。簡而言之,植入物插入后,水分子以及含有蛋白質的液體如唾液,齦溝液和血清等結合到植入物表面并結合離子形成富含蛋白質的薄膜并最終形成生物膜,微生物附著在生物膜上,增加了種植體周圍組織炎癥產生的可能性并使得支撐骨逐漸破壞。
鑒定特定表面相關的口腔微生物群對于理解植入物的初始細菌定植和疾病的潛在發展是必不可少的。眾所周知,一些牙周病相關細菌早在牙種植體植入后30分鐘就被發現存在于表面。目前,基于16S rDNA測序技術已被用于鑒定口腔環境中的潛在病原體,并且該策略具有檢測潛在細菌群落的完整基因組的優勢。

主要材料:
將8個正常加工的鈦盤和8個表面粗糙處理的鈦盤(SLA)安裝在4名患者的可移除的口內夾板上。 在口內暴露24小時后,從鈦盤和上下齦下牙齒區域收集生物膜樣品。對每個樣品的16S rDNA基因進行擴增并用Miseq Illumina儀器測序。

主要分析流程:

OTU聚類:
通過DNACLUST 3對序列進行聚類,去除其中豐度低于3的分類,并以UCHIME denovo和UCHIME作為參考鑒定其中的嵌合體,最終完成OTU的聚類分析。

OTU物種分類:
OTU通過核糖體數據庫項目(RDP)的分類工具以及其中的數據集進行OTU的物種分類鑒定。

OUT 進化分析
OUT 通過PyNAST比對到Greengenes core數據集上,并提取聯配結果其中變異度較高的聯配結果,并通過FastTree進行進化樹的構建。

OUT多樣性指數等分析
使用QIIME軟件包計算α(觀察到的物種)和β()多樣性指數,分類學分類,UPGMA聚類和OTU熱圖。

主要結果:

1、測序數據概況
分析中共用到663, 943條序列,所有的序列控制到固定長度165bp并按照3%的遺傳距離聚類到共541個OTU中,正常加工的和SLA兩組數據有相似數量的OTU結果,如圖1所示。

 
圖1 不同處理的OTU聚類結果。

OTU多樣性以及物種情況
總體來看,OTU可以劃分到36個更高等級的分類中,包括29個屬和7個更大的分類(比如科,目、綱等),代表的有Firmicutes, Proteobacteria, Fusobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Synergistetes 和TM7 七個門 ,其中Firmicutes占所有序列的48.4%。在這些分類中,兩種處理的OTU數量沒有出現明顯的不同,同樣在整體中數量也類似(圖2)。其中Synergistetes 這個分類僅在SLA有發現。
 
圖2 OTU鑒定結果的主要分類的豐度分布圖。

在牙齒,SLA和正常加工鈦盤表面鑒定出的細菌分類數量分別是36,27和26。三種不同處理中的細菌分類比例在圖三中可以觀察到,其中比例低于1%的分類沒有被包括。
 
圖3 三種不同處理鑒定出的OTU的細菌分類比例圓餅圖。


在正常機器處理鈦盤和牙齒表面鑒定的細菌屬基本均能在SLA表面找到,如圖4a所示。屬Kingella, Anaeroglobus, Tannerella and TG5在SLA表面能夠找到,但不能在正常機器處理鈦盤表面找到,而屬Selenomonas和Eikenella在正常機器處理鈦盤表面能夠找到而不能在SLA表面找到。結合圖4a和b來看,屬Jhonsonella, Dialister, Corynebacterium, Cardiobac- terium 和目EW055僅在牙齒表面發現。
 
圖4 三種不同處理按照屬分類


圖5代表的是所有鑒定出的OTU所構建的進化樹,不同顏色代表不同的門。

 圖5 三種不同處理鑒定出的所有OTU所構建的進化樹。

Chao1指數和Shannon 多態性兩個說明微生物物種豐度的結果均指向SLA處理的表面樣本均比正常機器處理的表面樣本豐度高,而牙齒表面的微生物豐度高于SLA處理和正常機器處理表面的豐度。




 
圖6 三種不同處理表面微生物豐度分布圖。



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