宏基因組分析案例

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 通過宏基因組測序揭示了蚊子微生物群與瘧疾載體中的殺蟲劑抗性之間的聯系
Whole metagenome sequencing reveals links between mosquito microbiota and insecticide resistance in malaria vectors
Scientific Reports (2018 8:2084
DOI:10.1038/s41598-018-20367-4

背景
殺蟲劑抗藥性是對全球瘧疾控制問題中面臨的迅速出現的威脅,特別是在非洲撒哈拉以南地區,但在拉丁美洲,工作重點已經從控制瘧疾轉移到了消除瘧疾。瘧疾病媒的控制主要依賴于室內殺蟲劑噴灑和長效殺蟲網來減少病媒群體數量和保護人們免受潛在的傳染性蚊蟲叮咬。這兩種方法都是使用化學殺蟲劑從而使得靶向群體產生殺蟲劑抗藥性,目前瘧疾媒介中殺蟲劑抗性的演變機制正被廣泛研究中,特別是鑒于批準用于公共衛生用途的殺蟲劑種類十分有限的情況下。迄今為止,瘧疾載體殺蟲劑抗性有四個可能的關鍵機制:靶位點不敏感、代謝抗性、行為改變和角質層改變。
據報道,拉丁美洲主要的沿海瘧疾病媒按蚊(Anopheles albimanus)表現出多種殺蟲劑抗藥性,包括有機磷酸酯(OP)抗性。到目前為止,已有兩種機制記錄了An. albimanus的OP抗性:涉及非特異性酯酶水平升高的代謝抗性機制以及涉及乙酰膽堿酯酶(AChE)不敏感的靶向位點抗性機制。但是在An. Albimanus中殺蟲劑抗性的選擇模式和潛在導致對OP和其他類殺蟲劑產生抗藥性的因素仍然很大程度上尚未發現。
微生物在各種環境中定殖,包括昆蟲組織,同時進行各種代謝功能,包括殺蟲劑的降解。已有研究發現微生物與農業害蟲的殺蟲劑抗性相關,但它們與蚊子殺蟲劑抗性是否相關尚不清楚。目前已有一些研究對蚊子的中重要的微生物種屬等進行了研究,以確定它們在蚊子行為,生物學和病原體傳播中的作用,以及它們在殺蟲劑抗性中的潛在作用。而大多數與瘧疾病媒殺蟲劑抗藥性的研究主要集中在撒哈拉以南地區非洲和東南亞的蚊子中,對拉丁美洲瘧疾載體的研究很少,尤其是An. albimanus。


主要材料方法
1.    數據: 用于宏基因組測序的選用的是在5倍致死劑量殺螟松30分鐘觀察的雌性An. Albimanus,存活下來的為抗型,否則為易感型。宏基因組測序的原始序列已經上傳到NCBI,數據編號為SRP108310。
2.    分析流程:
a.    原始序列質量控制:質量控制、去除接頭以及低質量序列通過FastQC v0.11.5和Trimmomatic v0.35完成。
b.    去除蚊子基因組序列:指控后的序列通過BWA v0.77比對到An. Albimanus參考基因組(AalbS2),去除其中比對上的序列,剩下的序列用于下游分析。
c.    物種分類和功能注釋:基因中序列通過DIAMOND v0.8.6中的BLASTx比對到NCBI-NR數據庫,比對結果相近的序列組合在一起然后通過MEGAN v6.5.6中的LCA算法比對到NCBI物種數據庫((prot-acc2taxid-August2016.bin)和KEGG數據庫(gi2kegg-Feb2015X.bin)用于物種分類和功能注釋。
d.    比較和統計分析:通過使用FEN_Res和FEN_Sus的 MEGAN 文件生成了單個MEGAN比較文件。每個樣本的Simpson倒數指數通過MEGAN產生,以確定樣本的物種多樣性(確定的細菌分類群的數量)和均勻度(相對的每個樣本中每個標識的分類群的豐度)。通過STAMP v2.1.3分析比較文件產生每個分類的物種數量  、豐度以及KEGG功能注釋的統計分析結果。對于每個樣品,分配給每個鑒定的分類/功能的讀數的相對豐度是計算。樣品間的相對豐度結果使用Two-sided Fisher進行精確檢驗并用Benjamini-Hochberg FDR校正。 樣品的顯著性標準設定為p <0.05,并且在兩個樣本中小于100的比對讀序的分組為未分類。




主要結果
1.    基礎統計結果:
不同殺螟松抗性的雌性An. Albimanus進行混池宏基因組測序(抗型共30個個體,感性共10個個體)。共產生抗型83,947,332和易感型60,444,900條原始讀序,其中分別91%和84%的讀序經過質量控制,在去除序列低質量部分后,讀序長度在60~232bp之間。在去除比對到An. Albimanus基因組上的序列后,共有63%和68%的抗型和易感型的讀序保留。此外還有0.9%和0.8%的抗型和易感型的讀序比對到細菌異型生物質降解通路的蛋白序列上。
2.    殺螟松抗型和易感型之間的細菌組成差異,其中在抗型中一種降解有機磷酸酯(OP)的細菌Klebsiella pneumoniae顯著富集:
基于比對到NCBI-NR庫以及使用NCBI分類樹分析的結果,在抗型和易感型中共鑒定出103種細菌和一種未培養的β-變形桿菌(CBNPD1),共包括四個門,6個綱,12個目,13個科和37個屬(圖1)。其中37個屬中的32個在抗型和易感型中均可以發現,而兩個屬(Bacillus 和 Halomonas)是抗型獨有的,三個屬(Stenotrophomonas, Microbacterium 和Lelliottia)是易感型特有。自上而下,Proteobacteria、Gammaproteobacteria、Enterobacteriales 和 Pseudomonadales分別是豐度最大的細菌門(99%)、綱(98%)、屬(93%)。如圖1所示,在屬的層面,Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Escherichia, 和Salmonella占總讀數的93%以上。其中豐度最大的細菌種Klebsiella pneumoniae在抗型和易感型中分別占有74%和49%。
 
圖1 殺螟松抗型和易感型基于序列比對到NCBI-NR庫的細菌分類組成結果

在抗型和易感型之間確定的細菌類群的相對豐度方面存在顯著差異。在抗型中具有較低的Simpson倒數指數(衡量分類豐富度和均勻度),抗型為1.4與易感型2.5。在兩個樣品中鑒定的四種細菌門中,Firmicutes 和 Actinobacteria相對豐度抗型明顯高于易感型(p <0.0001),但在抗型中具有相應較低的(p <0.0001)Proteobacteria相對豐度。32種細菌屬中的18個相對豐度抗型明顯高于易感型(p <0.0001)。 這些富集的細菌屬包括三個優勢屬, Klebsiella,Escherichia和Salmonella,其中Klebsiella是抗型中最富集的(差異達到 25.2%,p <0.0001)(圖2)。 在抗型中相對豐度顯著減少的有14個屬(表1),其中Enterobacter表現出最大的減少幅度(差異達 -21.5%,p <0.0001)(圖2)。

 
圖2 殺螟松抗型和易感型主要細菌屬的相對豐度差異
3.    殺螟松抗型和易感型之間的細菌異生素降解酶豐度差異,其中在抗型中存在OP降解羧酸酯酶抗磷酸和磷酸單酯酶富集:
基于KEGG對于讀序的注釋,共鑒定出88種細菌異生物降解酶,其中包括所有六類主要的酶:氧化還原酶,轉移酶,水解酶,異構酶,裂解酶和連接酶,其中每個樣品中超過80%由氧化還原酶,轉移酶和水解酶構成超過80%。
 
圖3 殺螟松抗型和易感型中異生素降解相關細菌酶分類相對豐度比較

水解酶(差異度 2.55%),異構酶(差異度 1.15%)和裂解酶(差異度 0.39%)的相對豐度相對于易感型在抗型中更高。這和抗型中的氧化還原酶的(差異度 -3.12%),連接酶(差異度 -0.44%),轉移酶(差異度 -0.34%)和異構酶(差異度-0.22%)等的相對豐度降低保持統一(圖3)。其中水解酶,最富集的酶類是由由兩個顯著富集(p <0.0001)的羧酸酯酶組成;  在抗型中,由兩個顯著富集的水解酶(p <0.0001)和兩類顯著富集(p <0.0001)的磷酸單酯酶,其中羧酸酯酶總體上最富集(圖4)。除連接酶外,剩余酶中的其他六種酶也在抗型中顯著富集(p <0.0001)(圖4)。

 
圖4 殺螟松抗型和易感型中涉及到的異生素降解相關細菌酶比較

4. 殺螟松抗型的微生物異生素降解途徑,由殺螟松降解和其他OP降解細菌物種組成,同樣也由體外殺蟲劑實驗驗證。
抗型中的與微生物異生素降解途徑相關的讀序比對結果顯示屬于11屬的21種細菌物種。這其中,13種細菌屬于主要的5個屬,Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Escherichia 和Salmonella。Bacillus屬的細菌僅在抗型中鑒定出。除了Pluribacter屬,抗型中每個與異生物降解相關的細菌屬包含已被證明可以降解OP化合物,包括殺螟松等以及其他類別的農藥。 同時通過宏基因組測序鑒定的抗型中的兩種OP降解細菌B. cereus 和A. baumanni通過體外殺蟲劑實驗得到驗證。



小結
該研究對An. Albimanus殺螟硫磷抗型(FEN_Res)和易感型(FEN_Sus)之間的微生物組分利用宏基因組測序(WMS)進行比較。介紹了抗型和易感型的微生物群和之間的差異,以及有關聯微生物群和異生物降解相關的微生物差異,其中在抗型的微生物群中和異生物降解相關微生物種類和相關通路顯著富集,并且其中兩類OP降解相關細菌通過體外實驗得到驗證。



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